熒光定量PCR實驗指南

1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；

2、引物、探針的設計；

3、引物探針的合成；

4、反應體系的配制；

5、反應條件的設定；

6、反應體系和條件的優(yōu)化；

7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；

8、標準品的制備；

從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)點的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，“file”菜單中的“import”，打開后“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，“file”菜單中的“open entrez sequence”，導入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對所有的序列進行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，“add” 或“add all”，然后“Done”導入要比較的序列，再“assemble”進行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時要設定比較序列的開始與結尾。有時因為參數(shù)設置的原因，可能分為幾組（contig），若想全部放在一組中進行比較，就調整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內的“minimum math percentage”默認設置為80，可調低即可。再選擇幾個組，“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在所分析的序列在一個“contig”內的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時因此個別序列原因，會出現(xiàn)重復序列，堿基的缺失或插入，要對“contig”的序列的排列進行修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性的排列。然后，“save”保存即可。分析時，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。

2.1引物設計  

細心地進行引物設計是PCR中重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：

²    序列選取應在基因的保守區(qū)段；

²    擴增片段長度根據(jù)技術的不同有所分別：
sybr green I技術對片段長度沒有特殊要求；
Taqman探針技術要求片段長度在50bp－150bp；

²    避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；

²    避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；

²    典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

²     引物之間的TM相差避免超過2℃；

²     引物的3’端避免使用堿基A；

²     引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。

²     為避免基因組的擴增，引物設計能跨兩個外顯子。

2.2  Taqman 探針設計 一般設計原則：

²     探針位置盡可能地靠近上游引物；

²     探針長度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。

²     探針的5’端應避免使用堿基G。

²     整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。

²     為確保引物探針的特異性，將設計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。（www.ncbi.nlm.nih/blast）

2.3  Taqman  MGB 探針設計介紹

MGB探針的優(yōu)點：

²     MGB探針較短（14-20bp），更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。

²     短片段探針（14-20bp）加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達到熒光探針Tm值的要求。

²     MGB探針的設計原則

²    探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針水解為單個堿基，與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。

²     用primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應為65-67℃。

²     盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。

²     盡量避免出現(xiàn)重復的堿基，尤其是G堿基，應避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復出現(xiàn)。

²     原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號）。因此，在進行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方（即必須確保探針的后兩個堿基是的保守），以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不保守。有幾個突變，突變位點也應靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設計簡并探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。

2.4 實時多重PCR探針的選擇：

多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標記探針，在檢測時可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴增不同長度的目的片段，反應中加入SYBRN染料，后根據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。

多重實時PCR的熒光探針應為同一類型：如同時為Taqman 探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon 探針。

在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:

設計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設計的多重引物或兩兩分別選中所設計的多重探針后，在“report”菜單下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進行評價（通常給出差的dG值，理論上是dG值越大越好）。

引物的設計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設計對于實時熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設計意味著的失敗。但是，好的設計并不等于好的實驗結果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進行介紹。

 3.1 引物退火溫度

引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

設定Tm有幾種公式。確定引物Tm可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法——從序列結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設置退火溫度時可以如下進行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴謹?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

引物的濃度會影響特異性。佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產(chǎn)物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。

一般商業(yè)合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。

濃度（μM）＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）

舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得：

濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM

 

定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復化學反應，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。

引物產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。在TE重溶引物，使其終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。

引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）多可以保存2個月。

探針即寡核苷酸進行熒光基團的標記，標記本身有效率的區(qū)別。探針標記以后一般應該純化，純度高、標記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達一年以上。不同的生物技術公司探針標記效率和純度有很大的區(qū)別。

由于反復凍融易導致探針降解，在確認探針質量好的情況下，稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。

熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受*，如定點突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。

限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能抑制酶的活性，因此并不能消除非特異性產(chǎn)物的擴增。

熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。

Transitor® Hot Start Taq酶對于自動熱啟動PCR來說可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎上進行了化學修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機粘連而形成的非特異性擴增。高溫條件下，化學修飾集團會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴增的進行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴增效率及產(chǎn)物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反應中，從而恢復聚合酶活性。

鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用 Transitor® Hot Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。

模板的質量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標準基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會抑制擴增反應。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質結合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應注意進行PCR 反應的模板質量，以增加PCR 反應的成功率。

起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴增和熒光PCR擴增，10⁴到10⁶個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的佳模板量取決于基因組的大小（下表）。舉例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當于3×10⁴到3×10⁵個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10－100ng的量就足夠檢測了。當然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴增效率。

 

表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例

 

 

 

PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。

可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進入eppendorf管內。為PCR樣品配制和擴增后分析設計隔離的區(qū)域，在準備新反應前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。

使用預先混合的反應成分，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。

一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。

 

影響PCR的因素如此之多，您有時很難區(qū)分是什么導致您的實驗結果不佳。降低實驗的不穩(wěn)定因素是使用可靠的產(chǎn)品。

使用、性能可靠的熱啟動酶、的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預混成的定量PCR試劑體系，大程度的降低了反應變量，提高了實驗的可重復性和可靠性。您還需要進行以下步驟的準備：設計引物和探針、合成引物和探針、正確儲藏、得到高質量的模板，隨后，您僅需要進行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實驗結果。

FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更的結果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時可以靈活地選擇您所喜歡的擴增條件，檢測方法和設備。

實時定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以、可重復地定量起始物質。FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）是一種方便使用的反應混合液，為定量分析進行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，擴增引物和熒光標記探針。您就可以得到實時qPCR所需的特異性和靈活性。

FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）提供了強大的PCR擴增，可以使用多個模板組。所使用的Taq DNA聚合酶具有熱啟動特性。這極大地降低和消除了錯誤配對和非特異性擴增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴增，從而降低了假陽性，使結果更可靠。

在產(chǎn)量和靈敏度方面，Quantitative PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）的靈敏度（閾循環(huán)）。您可以更地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內檢測線性劑量反應。

 

除了靈敏度和特異性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析設置，檢測方法和設備上給您提供了較高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：

對擴增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系。

可以更靈活的進行普通PCR和熒光PCR。

可以在多種設備上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。

可以利用多種檢測方法的優(yōu)點，包括TaqMan®探針和Molecular Beacon，您不必局限于特定的試劑盒。

 

ð  A2010A0101試劑盒：（探針體系）
FQ-PCR MasterMix-UNG混合物（2X） 25ul（終濃度為1×）；
上游引物（終濃度為50~900nM），下游引物（終濃度為50~900nM）；
探針（終濃度為200nM）；
待檢樣品 5ul（終濃度為10~100ng）；
無菌去離子水 補足，使總體積達到 50ul 。

ð A2010A0106 試劑盒:
反應體系終濃度：
1-2U的hot start Taq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2－0.4mM的dNTPs、1×PCR buffer（A2010A0106）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板,反應總體積通常為20－50ul

ð  自配熱啟動熒光－UNG 體系：

1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0104）；0.2-1U的UNG酶（A2010A0107）、0.2－0.4mM的d（A,C,G）TPs、0.3-0.6mMdUTP（A2010A0108）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板、反應總體積通常為20－50ul

使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start），大程度降低了需要優(yōu)化的參數(shù)。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更可靠的定量結果。對于特殊結構的熒光PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結果。

使用通用PCR Master Mix 試劑盒進行反應體系的配制，可以適合更多的反應體系，如mRNA的普通RT-PCR檢測，適用于合成質粒的PCR，同時也適用于熒光PCR，范圍更寬。

采用成套的hot start Taq酶，您需要對酶量、鎂離子濃度、UNG濃度、dUTP濃度、引物濃度、退火溫度等參數(shù)進行優(yōu)化（參照3：影響PCR及熒光PCR 的其他因素）進行優(yōu)化，優(yōu)化的指標越多，實驗的不確定性就越大。避免在操作中引入更大的不確定性和不可重復性。注意：同樣可參照的QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事項。

 

目前市場上有許多種實時PCR儀：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 （Applied Biosystems）；MX4000 （Stratagene）；iCycler （Bio-Rad）；Smartcycler（Cepheid）；Robocycler （MJ Research）；Lightcycler （Roche）；ROTORGENE（CORBERT） ；杭州博日（Linegene）。

不同的儀器使用方法有所區(qū)別，但都具備對Taqman 探針和sybgreen 染料法的檢測波長和檢測能力。QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均適合在這些儀器上進行使用。

為確保實驗數(shù)據(jù)的有效性，每次實驗都設陰性對照和4個標準品，每個樣品都平行做2個復孔。

基線或閥值的設定 通常是以10－15個循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性對照熒光值的高點作為基線。

 

8、疑難解答

 

 

1）、文獻上找到的引物和探針序列能否直接使用？